2024年2月，武汉大学泰康医学院（基础医学院）罗孟成教授实验室与西湖大学马丽佳教授实验室合作的文章Machine learning-based prediction models to guide the selection of Cas9 variants for efficient gene editing发表于Cell reports杂志。该论文采用了体外合成gRNA-target pairs的方法构建了超过360k的Oligo文库，并结合机器学习成功开发了用于帮助指导Cas9突变体以及gRNA优化选择的模型工具。武汉大学博士生李健波、吴攀峰以及西湖云谷智药曹周涛为共同第一作者；武汉大学泰康医学院（基础医学院）罗孟成教授和西湖大学马丽佳教授为共同通讯作者；武汉大学为论文第一完成单位。

Cas9介导的基因编辑包含了Cas9核酸酶以及gRNA两个主要组成部分，在gRNA的指引下完成靶序列的特异性编辑。尽管Cas9已经广泛的应运于微生物、动物、植物的基因编辑中，但是其经典的“NGG”PAM序列以及潜在脱靶风险仍阻碍着其在科研以及医疗中的应运。因此针对Cas9基因编辑系统的优化主要也围绕在Cas9核酸酶和gRNA上进行。目前对Cas9核酸酶的优化不仅包括在一些其他物种中探索发现新的同源核酸酶（如：FrCas9，CjCas9，NmCas9，SaCas9等），还包括了一些重新设计SpCas9蛋白编码序列的衍生突变体（如：SpCas9-NG，xCas9，HiFi Cas9，Sniper Cas9，evoCas9，Hypa Cas9，SuperFi Cas9等）。这些Cas9核酸酶或是可以编辑一些NGG以外的靶基因组位点或是拥有更小的脱靶风险，他们的出现无疑丰富了基因编辑系统工具的选择。在这些突变体的帮助下，无论是生殖、肿瘤亦或是其他领域都可以通过他们实现更高效的动物、细胞模型构建以及其他多方面用途。

同时近年来随着人工智能与生物医疗领域的紧密结合，基于机器学习模型的gRNA优化工具也在飞速发展，然而目前绝大多数的工具更多的聚焦于野生型SpCas9，针对一些极具潜力的Cas9突变体的研究尚缺乏足够的实验数据。在本研究中团队成员构建了一个包含多个Cas9突变体（SpCas9-NG，HiFi Cas9，Sniper Cas9，LZ3 Cas9）的高通量数据库，并以此为基础结合机器学习模型构建出8个用于分析不同突变体编辑活性以及特异性的预测模型，以保证提高Cas9编辑效率的同时有效规避脱靶风险。除此之外，本研究中也发现PAM远端区域的核苷酸组成对于HiFi Cas9和LZ3 Cas9的编辑活性发挥着重要作用。这部分非种子区域在此前的报道中对于野生型Cas9以及其他突变体并不会显著影响其编辑效率，该发现也进一步解释了HiFi Cas9和LZ3 Cas9具有更高编辑特异性的原因

总之，该研究为Cas9突变体的选择提供了一个很好的指导，帮助动物模型和细胞模型研究人员选择更适合，更高效的基因编辑工具。为了给来自不同领域的科研工作者带来更好的使用体验，这些Cas9突变体的预测工具可以通过访问我们的网站指导Cas9突变体的选择以及了解基因组靶序列的gRNA编辑活性和特异性排名（https：//crispr-aidit.com/home）。

该研究获得了武汉大学泰康生命医学中心、国家自然科学基金（32270905）、湖北省重点研发项目（2021BCA111）、辉凌生殖医学项目（FIRMC200509）、武汉大学中南医院-泰康医学院联合项目（ZNJC201928）等项目的资助。

原文链接：Machine learning-based prediction models to guide the selection of Cas9 variants for efficient gene editing - PubMed (nih.gov)。

据悉，罗孟成教授本科和博士均毕业于武汉大学，博后在美国宾夕法尼亚从事生殖发育研究。 2016年获批国家级青年人才项目回国建立独立科研团队，研究方向聚焦于精子发生与男性不育，采用基因编辑手段构建动物模型，致力于阐明男性不育的致病机制，开发临床诊治方案和男性避孕药。至今为止，罗孟成教授在男性生殖领域已取得多项重要成果，包括： 1）发现并命名了一个X染色体上的雄性性别决定基因SDX，完善了哺乳动物雄性性别决定理论；2）揭示了Dot1l在精原干细胞自我更新过程中的作用机制；3）鉴定了一个人类不孕不育新靶标-MEIOB。近五年以通讯/共同通讯作者身份发表Cell Reports(2024)、Cell Research（2022）、Genes & Development(2022)、Cell Proliferation（2021）、 Science Advances（2020）等文章多篇。其中，MEIOB基因突变会导致人类男性和女性完全不育，相关成果已收录入领域核心综述和教材，并作为非梗阻性无精子症（NOA）检测基因之一收录入中外临床共识和指南，在生殖临床上全面推广应用，目前正在研发针对MEIOB的男性避孕药。SDX基因调控支持细胞发育和功能，其突变导致性别逆转或睾丸早衰，已得到临床病例支持，正在研究致病机制和临床诊治方案。

（撰稿：李健波  审稿：梁凯威）